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[rAAV] rAAVの精製方法 – 澄明ろ過及び膜による – ID2532 [2019/11/05]

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harikiri

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rAAVの精製方法

2016年の文献よりAAVの精製について解説する。また、Pall製品による精製についても解説する。

文献によれば、最終的には超遠心によりAAVベクターを濃縮精製するが、その超遠心では、CsCl濃度勾配を使用しない方法を提供する。遠心操作を多用したAAVベクター精製は、遠心機があれば簡単に行える。

  • Transfection of HEK293, and post culture
    • 20 Flasks of T-150, Three (3) Plasmid PEI
    • (説明: フラスコでHEK293細胞を培養した後，ポリエイレンイミンでプラスミドを細胞内にトランスフェクションスル)
  • Centrifugation
    • 3,000 xg 10 min
    • (説明: 遠心で細胞画分を回収する)
  • (A) Lysis by Freeze-thaw, and (B) Nuclease, (C) sodium deoxycholate
    • (A) 50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 2mM MgCl2, pH8, Dry ice – ethanol ←→ 37℃ 交互に細胞破砕
    • (B) Benzonase: 50 u/mL, RNase: 10U/mL, 37℃、30min
    • (C) 0.5% sodium deoxycholate, 37℃, 30min
    • (説明: 回収した細胞を凍結融解して破砕，Nucleaseで核酸を切断，Sodium deoxycholate処理する)
  • Centrifugation
    • 2,500 g x 10min/sup
    • Pooling with cell culture supernatant
    • (説明: 遠心して上清を回収する)
  • PEG 8000, NaCl Treatment / ppt
    • 8% PEG 8000, 0.5M NaCl by 40% PEG 8000, 2.5M NaCl
    • Incubation 1h , RT
    • (説明: 最終8% PEG, 0.5M NaClに調整し1時間室温で静置して沈殿化)
  • Centrifugation 2,000 g x 30min
    • Re-suspend with HEPES buffer
    • (説明: 遠心して沈殿を回収しHEPES バッファで沈殿を懸濁および融解する)
  • Chloroform Extraction / cfg-sup / Evaporate
    • Add equal volume of chroroform
    • Vortex going , 2min, RT
    • cfg (370 g x 5min)/supernatnat
    • Evaporate 30min, RT
    • (説明: HEPESバッファで懸濁・融解した液に対して，クロロホルム添加により，(おそらく)水相にAAVを抽出する)
  • PEG 8000, AmSO4 Treatment / AAV in sup
    • 10% PEG 8000, 13.2% AmSO4 pH8.0 adjusted by stocked solution
    • Incubation at RT
    • (Impurity salt out ppt), HEPES buffer pH has to be kept at pH8.0, AAV stable is Alkaline that acid
    • (説明: PEG8000と硫酸アンモニウムで不純物を沈殿化し，AAVを上清に回収する)
  • Dialysis using 50kDa
    • diluent: PBS or MEMEM media with 0.001% puluronic F68 for preventing the aggregation
    • (説明: 分画分子量50kDaのUF膜を用いてPBSまたはMEMEMにバッファ置換する．プルロニックF68は凝集抑制に効果がある)

清澄ろ過

Pall製品による清朝濾過。

  • PHD11 : cellulose based capsule
  • PDP8 + Bio 10 : Bio 10のみではろ過量が少ないが、PDP8の組み合わせで良好にろ過が可能

AEX Membrane

Pall 製品とこれらを用いたPallとのCo-Developingがサービスとして可能です。

  • Mustang Q membrane chromatography for enriched full capsids
    • Labの超遠心の代替
    • Mustang Membrane: 8000A pores vs polymer matrix:Packed 40-90μm beads 300-1000A pores
  • AAV5 gradient Elution by Mustang Q XT Membrane in Acrodisc Capsule
    • Step elution : Empty in 1st elution, full in 2nd elution
    • Peak 1 : 10 mS/cm, 13E11
    • Peak 2 : 14 mS/cm, 7E11
  • TFF
    • 100kDa for AAV, 300kDa for LV
    • TMP : 0.5 ~ 0.8 bar
    • Shear rate : <4,000 second-1 for hollow fibers; <4 L/min/m2 for cassettes.
    • J=K*ln(Cbulk/Cconc)

文献

Inexpensive, serotype-independent protocol for native and bioengineered recombinant adeno-associated virus purification

http://www.jbmethods.org/jbm/article/download/102/90

編集履歴

2019/10/04 Mr.Harikiri
2020/10/01 文言整備
2020/11/05 追記 (Pall膜製品による精製 Pall Webinarより)
2023/10/24 追記 (説明を追加)

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