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[rAAV-Lab] AAVの発現・精製から動物試験までの手順をNovagenのAAV精製キット説明書から知る – ID2407 [2019/09/26]

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harikiri

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はじめに

AAV vectorを精製するNovagenのキットの紹介です。私たち研究者のナレッジにしてしまいしょう．

手順は，(1)前培養、(2)トランスフェクシ，さらに(3)後培養(AAV増殖)

(4)ハーベトス，(5)当該キットによる精製，(6)100kDaのUF膜を用いた濃縮，および(7)除菌ろ過で精製サンプル取得というのが，AAV vector取得の手順です．

その後，目的のDNAが取得できているか評価するためには(8)AAV vectorからDNA抽出、(9)PCRによる目的遺伝子の確認、(10)動物への投与に至ります．

Purification of Adeno-associated Virus (AAV) Vectors Using Norgen’s AAV Purification Kit
NORGEN Biotek Corp.

AAV Production

  1. 培養条件: HEK細胞と濃度，培養スケール，培地組成
    • Cell seed 10e7 HEK293 cells/15cm plates,
    • DMEM, 10% FBS, 2mM L-glutamine,
    • penicillin/streptomycin
  2. トランスフェクション: 培養1日後に細胞に封入させる遺伝子(pDNA)
    • Transfection (plasmids: rep/cap, genome, helper, containing the inverted terminal repeat (ITR) )after one day
  3. 後培養: トランスフェクション1日後に培地交換
    • Change media after one day, DMEM+L-glutamine (no serum)
  4. ハーベスト: 上清回収は後培養後3～6日
    • Harvest after 3-6days

AAV Purification

5. AAVの精製: AAVを増殖させた培養液を用いて精製します．

  • For in vitro and vivo, 300mL of AAV9 containing media
  • 33mL fo 300mL ->Norgen AAV purification kit -> eluate (9.9mL) ->

6. 濃縮: 遠心型のUF膜を用いた濃縮

  • concentration 100kDa centrifugal filter unit Amicon Ultra-4
  • Collection: 0.5mL

7. 除菌ろ過 (0.22μm)

  • 吸着が少ないタイプを使用(例えばDurapore)

DNA Extraction

8. DNAの抽出:

  • Sample,5μL + 4μL(2 units) DNase (Norgen’s Kit) ->
  • Incubation 37’c for 30min ->
  • EDTA add final 5mM ->
  • Heating 90’c for 20min (inactivation DNase)

qPCR Quantification

9. qPCRによる目的遺伝子の確認

In vitro Transduction with AAV

10. 動物投与試験: In vivo administration of AAV

  • Purified sample (Concentrated by UF 100kDa)
  • Dilution to 4 x 10e11/0.5mL
  • 2 divided volume
  • 2 mice C57BL/6, ~1 x 10e11/mice
  • mice tissues harvesting 1m post transduction

文献

NORGEN: Purification of Aden-associated Virus (AAV Vectors Using  Norgen’s AAV Purification Kit

編集履歴

2019/09/26, Mr.HARIKIRI
2023/11/07, 文言整備

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