目次
- 1 rAAV vectorの精製方法
- 1.1 Transfection of HEK293, and post culture
- 1.2 Centrifugation / cell pellet
- 1.3 (A) Lysis by Freeze-thaw, and (B) Nuclease, (C) sodium deoxycholate
- 1.4 cfg (2,500 g x 10min)/sup
- 1.5 PEG 8000, NaCl Treatment / ppt
- 1.6 Chloroform Extraction / cfg-sup /Evaporate
- 1.7 PEG 8000, AmSO4 Treatment / AAV in sup
- 1.8 Dialysis using 50kDa
rAAV vectorの精製方法
以下のReviewにおけるOptimized purificationの精製方法は、Ultracentrifugationを用いずにAAVを精製している文献である。
Transfection of HEK293, and post culture
20 Flasks of T-150, 3 Plasmid PEI
Centrifugation / cell pellet
3,000 xg 10min
(A) Lysis by Freeze-thaw, and (B) Nuclease, (C) sodium deoxycholate
(A) 50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 2mM NgCl2, pH8, Dry ice-ethanol 
(B) Benzonase: 50u/mL, RNase: 10U/mL, 37℃, 30min
(C) 0.5% sodium deoxycholate, 37℃, 30min
cfg (2,500 g x 10min)/sup
Pooling with cell culture supernatant
PEG 8000, NaCl Treatment / ppt
1. 8% PEG 8000, 0.5M NaCl by 40% PEG 8000, 2.5M NaCld, incubation 1h, RT.
2. centrifuge 2,000g x 30min
3. Re-suspend with HEPES buffer
Chloroform Extraction / cfg-sup /Evaporate
疎水性タンパクとPEGを除去
1. Add equal volume of chloroform
2. Vortex going , 2min , RT.
3. cfg (370g x 5min) (おそらく水層にAAV)
4.. Evaporate 30min , RT
PEG 8000, AmSO4 Treatment / AAV in sup
1. 10% PEG 8000, 13.2% AmSO4 pH8.0 adjusted by stocked solution
2., Incubation at RT.
(Impurity salt out in ppt), HEPES buffer pH has to be kept at pH8.0, AAV stable is Alkaline that acid.
Dialysis using 50kDa
diligent: PBS or MEMEM media with 0.001% puluronic F68 for preventing the aggregation.
by Amazon ID13211 by Amazon ID19245
用語の解説、関連タグ付き投稿の抽出
AAV
DSP
purification
rAAV-production
Update ID21920
[Bio-Edu] mRNAワクチンの剤形 – LNP; Lipid Nano Particle – △[2021/12/05]
Post Views: 126 ID15607 目次1 はじめに2 参考文献よりLNPを解説3 LNPの組成4 LNPを作る装置5 編集履歴 はじめに mRNAワクチンの細胞内への伝達としてLNP技術が用いられます。Li […]
[WordPress] AMP対応化で、使用しているその他のプラグインによるエラーが出ないようにするために – プラグイン別 [2020/11/16] ID24858
Post Views: 58 目次1 はじめに2 基本的な設定方法3 WordPress プラグイン別3.1 Content of Table Plus はじめに AMPプラグインをインストールしている場合、投稿/ページ […]
[サイバー攻撃] 最近のサイバー攻撃対策をCanonのESETソリューションの解説から理解する ID26175 [2020/12/20]
Post Views: 65 目次1 サイバー攻撃2 1. 基本的防御2.1 CanonのESETソリューション3 2. プラスアルファ防御3.1 ESETソリューション4 事後対策4.1 ESETソリューション5 予防 […]
by Amaozn ID13196 by Amazon ID13339
最新記事(rAAV)
[rAAV-Edu] rAAVベクターのFull/Empty ratioの改善のヒント
Post Views: 17 ID32218 目次1 Full & Empty ratio2 考察3 編集履歴 Full & Empty ratio rAAV Vectorの実製造にあたって、ウイルス粒子 […]
[Bio-Vector] 人工染色体 – 目的細胞に導入して安定発現細胞株を作る – AAVベクターの生産株として適用できるのか? – chromocenter/TaKaRa – ID26979 [2021/01/15]
Post Views: 69 目次1 はじめに2 ウイルスベクターの新たな作り方3 人工染色体の特徴4 人工染色体の構造5 遺伝子搭載サイズ6 従来ベタクーとの比較7 chromocenter社の方法7.1 ドナー細胞の […]
[Bio-Edu] 遺伝子治療医薬品の開発における、研究グレードとGMP – ID26219 [2020/12/22]
Post Views: 61 目次1 はじめに2 マテリアルの選択2.1 候補(導入遺伝子)がない2.2 候補がある2.3 前臨床が完了していない2.4 前臨床か完了している3 開発プロセス はじめに Vigene社がサ […]
ITR ; 末端逆位反復配列
Post Views: 72 ITR; Inverted Terminal Repeat; 末端逆位反復配列、AAVゲノムは4.7kbの一本鎖DNAであり、両末端に1つずつの145塩基のITRを持つ。ITRはT型のヘアピ […]
気になる企業 – Molecular Medicine ;MolMed – [2020/11/09]
Post Views: 58 ID12516 目次1 MolMed1.1 サービス2 AGCが買収 MolMed イタリア ウイルス・ベクターを用いた遺伝子治療薬製造のCDMO サービス MolMed独自のテクノロジーを […]
[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは，empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である △- ID24561 [2021/02/23]
Post Views: 85 目次1 はじめに2 ウイルスの等電点(pI or IEP)3 ウイルスの等電点の検証結果の詳細4 AAV1~AAV10のpI計算5 AAV8, AAV9のpI6 AAV tree7 編集履歴 […]
最新記事(Biologics, ID:14673)
[COVID-19] 飲む治療薬 Molnupiravir (Lagevrio) – EUの当局(EMA)が各国に対して使用に関するアドバイスを発行した [2021/11/19]
Post Views: 11 ID35044 目次1 CODIV-19の飲む治療薬2 参考3 編集履歴 CODIV-19の飲む治療薬 先日、イギリスの当局 (Medicines and Healthcare produc […]
[COVID-19] 飲む治療薬 Molnupiravir イギリスで世界初承認、日本にも承認申請 [2021/11/06]
Post Views: 17 ID34477 [2021/11/06] 目次1 CODIV-19の飲む治療薬2 参考3 編集履歴 CODIV-19の飲む治療薬 イギリスの当局 (Medicines and Healthc […]
[抗体医薬] COVID-19治療用抗体医薬カクテル
Post Views: 14 ID31303 [2021/09/13] 目次1 はじめに2 抗体カクテル療法3 効果のある抗体医薬4 ロナプリープ5 編集履歴 はじめに 新型コロナウイルスの感染拡大を抑制するには、ワクチ […]
[用語] ADC : – Antibody Drug Conjugates – ID27100 [2021/01/19]
Post Views: 8 目次1 ADC2 編集履歴 ADC Antibody-Drug-Conjugatesの略号。 抗がん剤などのDrugをある組織に特異的に届けたい場合に、その組織に特異的なモノクローナル抗体(A […]
[rAAV-Edu] rAAVベクターのFull/Empty ratioの改善のヒント
Post Views: 17 ID32218 目次1 Full & Empty ratio2 考察3 編集履歴 Full & Empty ratio rAAV Vectorの実製造にあたって、ウイルス粒子 […]
最新記事(Education)
[Bio-Culture] 大腸菌; E.coliの増殖率は細胞長の増大に関わる – ID28121 [2021/02/27]
Post Views: 52 目次1 大腸菌の増殖率2 編集履歴 大腸菌の増殖率 一般的に、大腸菌の増殖率(growth rate)、1時間あたり1未満であり、それを超える増殖率になってくると、大腸菌の長さが増大するのだ […]
[Bio-Culture] Poloxamer 188 – バイオリアクターの撹拌翼による細胞のダメージを抑制 – ID28021 [2021/02/24]
Post Views: 60 目次1 Poloxamer 1882 毒性2.1 動物の静脈内注射 (Poloxamer)2.2 ヒトの静脈内注射 (Poloxamer 188)2.3 創傷治癒2.4 動物実験2.5 AM […]
[Bio-Edu] イオン交換クロマトグラフィの原理 – バイオロジクスの製造における基本 – ID27722 [2021/02/13]
Post Views: 58 目次1 イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ2 実務では3 原理4 なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか4.1 pHの理解5 編集履歴 イオン交換の原理を使ったクロマト […]
[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは，empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である △- ID24561 [2021/02/23]
Post Views: 85 目次1 はじめに2 ウイルスの等電点(pI or IEP)3 ウイルスの等電点の検証結果の詳細4 AAV1~AAV10のpI計算5 AAV8, AAV9のpI6 AAV tree7 編集履歴 […]
[Bio-Education] 医薬品の開発スケジュール – ID23493 [2021/04/08]
Post Views: 53 目次1 医薬品の開発スケジュールの概要2 バイオロジクスの開発における細胞株から製造方法3 Cell Bankの作成3.1 Fraunhofer ITEMのサービスから4 ICHQ5D5 編 […]
その他記事(ALL-RANDOM, ID:16786)
[健康] 白内障 – 術後(体験) – 2週以降の経過・日常生活のまとめ – △ID12705 [2020/04/17]
Post Views: 69 目次1 日常生活で気付いた点2 編集履歴3 白内障手術の術前/術後4 術後の検診4.1 術後から約10日後までの点眼4.2 術後、約10日後(3/27)から新たに開始する点眼、4/17まで。 […]
[Bio-Process] ハーベスト工程・培養上清の回収 – ID8290 [2020/02/01]
Post Views: 50 目次1 ハーベスト2 ろ過膜の特徴3 編集履歴 ハーベスト 規定の期間の培養が終了した細胞培養液は、細胞を取り除き培養上清を取得する。この工程をHarvestと呼美ます。 図1に示すミリポア […]
[用語] NIAID; アメリカ国立アレルギー・感染症研究所 ID18765
Post Views: 57 目次1 NIAID2 編集履歴 NIAID アメリカ国立アレルギー・感染症研究所 (NIAID; National Institute of Allergy and Infecti […]